线粒体氧化活性在CHO细胞乳酸代谢中的角色

2022-08-03 15:21:09

背景介绍

哺乳动物细胞培养工艺开发中，乳酸产量是一个重要的检测指标，大量乳酸的积累不仅浪费了能源，还使培养体系的pH持续降低，从而抑制了细胞的生长和抗体蛋白产物的积累。目前培养工艺中所期望的乳酸代谢是由对数生长期的产乳酸向进入平台期后的耗乳酸转变。但是，乳酸代谢表型的转变是难以被控制的非普遍现象，因此在哺乳动物细胞培养工艺中对于乳酸代谢的调控机制有待进一步的探究。

化学限定性无血清培养基富含葡萄糖和谷氨酰胺，作为能源支持哺乳动物细胞的快速生长和产物代谢。而发生在细胞质中的糖酵解途径和谷氨酰胺分解均会产生乳酸。

目前所报道的关于抑制产乳酸或促使其代谢向消耗型转变的方法包含了如下几种：

利用细胞工程技术下调乳酸脱氢酶的表达或者上调丙酮酸羧化酶的表达；使用低代谢速率的碳源代替葡萄糖和谷氨酰胺；
制定精确的糖流加策略；
辅助以基因组学和蛋白质组学更好的了解乳酸代谢表型。

尽管如此，考虑到细胞内碳代谢和调控的复杂性，我们还需要更全面的去探究乳酸的代谢机制，进一步控制其在工业生产中的积累。

碳代谢和乳酸代谢途径的转变均离不开线粒体，再基于以往的文献报道，提出假设：线粒体的氧化活性或者特定的底物转运载体可能会影响乳酸代谢向耗乳酸途径的转变。本文以CHO-S细胞株（对照）及其非重组亚克隆细胞株（亚克隆）作为研究对象，通过检测两株细胞的线粒体膜电势和耗氧量来对比两者的线粒体氧化活性，并在后续的实验中探究了培养基类型对于细胞乳酸代谢的影响。

实验结果

两株细胞在1号培养基中生长状态、葡萄糖和谷氨酰胺代谢表型均相似，但是乳酸代谢不一致（Fig. 1）。从第5天起，CHO-S细胞株开始向耗乳酸代谢途径转变，此代谢转变与培养体系中谷氨酰胺含量的快速消耗同步，而葡萄糖含量仍处于较高水平。

有趣的是，伴随着第5天谷氨酰胺的流加，CHO-S细胞株产乳酸水平出现了短暂且与谷氨酰胺添加量呈化学计量关系的提升（Fig. 2C）。基于此，本文提出假设：在细胞培养的前5天，谷氨酰胺代谢显著影响了乳酸的生成，而一旦谷氨酰胺耗尽，耗乳酸途径开启以弥补TCA循环底物的不足。而亚克隆所表现出的产乳酸却持续了很长时间，最终当培养体系中的谷氨酰胺和葡萄糖均耗尽时，乳酸代谢才转变为耗乳酸（Fig. 1D; Fig. 2D）。

随后，利用1号培养基检测了三种不同起始浓度葡萄糖（44.4mM, 55.5mM, 66.6mM）对于乳酸代谢的影响（Fig. 3）。对于CHO-S细胞，更高浓度的碳源对于乳酸代谢没有显著影响；而在亚克隆细胞株中高浓度葡萄糖延迟了乳酸代谢的转变，同样，代谢转变的延迟同步于葡萄糖的耗尽。

基于本文的数据和以往的报道，我们可以确定谷氨酰胺能够调控哺乳动物细胞的乳酸代谢。当CHO-S细胞中的谷氨酰胺耗尽，细胞通过耗乳酸以弥补TCA循环水平的下降；而此现象在亚克隆细胞中没有发生，即在乳酸耗尽后，亚克隆细胞不能利用乳酸分解弥补线粒体的氧化代谢。因此本文推测亚克隆高水平的产乳酸与线粒体氧化活性的下降存在联系。

为证实以上推测，本论文通过检测两株细胞在1号培养基中不同阶段的线粒体膜电势和耗氧量（两者的相对值以亚克隆与CHO-S的百分比表示）来反映各自的线粒体活性。在培养前5天，亚克隆细胞与CHO-S细胞在线粒体膜电势和耗氧量方面没有显著性差异；但是相对膜电势在第7天降至80%，第9天降至60%；相对耗氧量也在第7天降至60%（Fig. 4）。有趣的是，膜电势和耗氧量的下降同步于两株细胞乳酸代谢表型的分歧。以上数据证实了本文的推测：亚克隆细胞株线粒体氧化活性的下降导致了高水平的产乳酸。

为了进一步探究细胞属性和培养基成分对于乳酸代谢的影响，本论文将两株细胞分别在2号专利培养基和商业化CD CHO培养基中培养。在2号培养基中，亚克隆与CHO-S细胞乳酸代谢均在第五天谷氨酰胺耗尽后转变为耗乳酸，相应的，两株细胞的线粒体膜电势和耗氧量水平一致，暗示了亚克隆细胞株线粒体氧化代谢活性的提升（Fig. 5A, B, C）。然而相较于1号培养基，CHO-S细胞在CD CHO培养基中表现出更高水平的持续产乳酸；相应的，该细胞线粒体膜电势和耗氧量均在第7天出现了明显的下降（Fig. 5D, E, F）。

结论

本论文研究表明细胞属性和培养基成分能够影响乳酸代谢，但是各实验条件下均检测到线粒体氧化代谢能力的受损。因此也证实了本文的推测：线粒体在调控细胞乳酸代谢进程中发挥了关键作用。我们假设乳酸进入TCA循环涉及了线粒体转运体系以及相关酶，后两者又会被培养基中未知的特定成分影响，从而抑制了耗乳酸代谢的转变。而进一步的研究需要证实以上的猜测，尤其是关键性线粒体蛋白表达分析有助于提高我们对CHO细胞乳酸代谢的全面理解和调控。