一篇NC文章告诉你circRNA研究新思路

一般circRNA的研究思路主要是ceRNA，即circRNA可以结合miRNA，使miRNA的靶基因上调；或者ceRNA可以降低其来源mRNA的翻译水平。但是今天分享的这篇NC文章提供了新思路！circRNA可以结合蛋白，阻止蛋白行使功能，产生生物学效应。

环状RNA在真核细胞中是广泛表达的，但是其于人类疾病的关系还不清楚。这里我们发现环状RNA circANRIL（circular antisense non-coding RNA in the INK4 locus）可以通过抑制rRNA的成熟，促进细胞的凋亡，抑制增殖，激活p53通路，达到防止动脉粥样硬化的作用。circANRIL来源于和动脉粥样硬化相关的基因位点，可以与rRNA前体竞争结合PES1蛋白，从而是rRNA前体在细胞内聚集，细胞和压力增加，引起核仁的碎裂，p53的激活，细胞凋亡，不会在动脉中形成斑块。

1. 发现circANRIL在不同程度的动脉粥样硬化的斑块内表达不同，与病重程度呈负相关。

2. circANRIL没有ceRNA的作用，也没有cis作用。过表达circANRIL,发现可以结合在circANRIL的三个miRNA没有变化，其来源的lncRNA也没有变化，其位点附近的mRNA同样没有变化。

3. 过表达circANRIL可以抑制平滑肌细胞和单核巨噬细胞的增殖，促进凋亡。

4. 由于circANRIL来源的lnc有结合蛋白的作用，所以作者用label-free检测了与circANRIL结合的蛋白谱。这个实验类似于chip-seq，作者先在circANRIL上加上BoxB的核酸序列，这个序列会与-N-peptide结合，然后再用抗体pull-down ，用label-free检测蛋白谱。富集分析发现circANRIL pull-down下来的蛋白主要在核糖体RNA的形成和RNA剪切上。然后作者重显著富积的蛋白中选择了几个与核糖体剪切相关的蛋白，做RIP验证，发现circANRIL可以显著结合PES1蛋白。

5. circANRIL和rRNA虽然不属于同一个RNA家族，但是有多个同源序列，且软件预测circANRIL与PES1的结合区域正是位于同源序列内，且PES1的结合区域就是其行使剪切rRNA前体的功能区域。

6. 验证过表达circANRIL，引起的rRNA前体的聚集和p53的激活，核仁的碎裂，细胞的凋亡；将PES1中与circANRIL结合的区域敲出，同样可以引起上述现象；但是在过表达circANRIL的细胞中补充PES1后可以抑制上述现象。

可借鉴之处

1. circRNA的过表达，在序列两端加上内含子的序列，有助于circRNA的形成。

2. circRNA的干扰，干扰circRNA的同时，也就干扰了其来源的基因；解决办法就是通过在干扰后的细胞中过表达circRNA，看性状是否消失。

3. 怎么预测circRNA是否可以与某个蛋白结合，其结合的区域是什么。文章中使用的是catRNPID的软件，有在线版的，使用方法见分割线以下的部分。

catRNPID在线软件的使用方法：

1. 打开网页http://service.tartaglialab.com/page/catrapid_group

如果打不开的话，就换用谷歌或火狐浏览器。会用到其中的两个工具：

2. 评估蛋白是否可以结合RNA，结合的区域是哪些

进入“catRAPID signature”，把蛋白序列粘贴入方框中，填写邮箱，点提交就可以了。蛋白的个数不能超过100个，总氨基酸不超过10万个。

蛋白序列的格式，像下面这样：

>Unigene0000024  

QEEEGLTGSSPSVENGVSEVLANRCDFKPVGSSELEEDEGFSDWSLKLEQRKQRSSGAQE

AEA

>Unigene0000025 

MNHLEVAQEVEVSDEPGNGQVNESVEADLEHFEVEEEQQQQYALPYSRQGRGDREGQPGH

EDEG

>Unigene0000034 

IKEEARRMIRNAQQVVALVMDIFTDVDLFSDLLDVAARRVPVYILLDDLNKQHFLDMAAK

CRVNLNYAEFLRVRTVSGPTYFCRTGMSFKGQLMEKFMLVDCNVVLSGNYSFMWSFEKIH

RSIAHIFQGELVASFDEEFRILFAQSEPLIPSETALIKMDNPFVMAPYSGTRPFYQRKLH

MMFPRDDSSMNSLPAYAD

过一阵时间（每个蛋白3分钟算），会把结果发邮箱中，告诉你每个蛋白的得分（0.5分之下，认为不具备结合RNA的能力），可能的RNA结合区域（有的得分超过0.5，但是不一定可以预测到RNA结合区域），如下：

3. 预测蛋白与某RNA的结合情况

进入“catRAPID fragments”，输入蛋白序列和RNA序列（格式同上），填邮箱提交。

后面会受到邮箱，点开结果链接就可以看到结果了，得到如下图的热图和表格。热图是png格式的，但是我们可以根据下面的表格画成pdf格式的热图。

嗯的，今天的分享就到这里啦~

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